Streptozotosin ile Diyabet Oluşturulmuş Sıçanlarda Oksitosinin Retinopati Üzerine Olan Koruyucu Etkisi

Diabetes mellitus, dünya çapında 230 milyondan fazla insanı etkileyen progresif bir hastalıktır. Diyabet vücutta hem mikrovasküler hem de makrovasküler yapıları etkiler ve sonuç olarak retinopati, nöropati ve nefropatiye neden olabilir. Diyabetik retinopati (DR), önlenebilir körlüğün önde gelen nedenidir. Kan şekerinin sürekli yüksek olması, kan damarlarının şişmesine ve damar dışına sıvı sızmasına neden olur ve retinanın mikrovasküler yapısına zarar verir. Bu, retinal iskemiye neden olarak vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) salgılanmasına ve immatür, frajil yeni damarlar gelişmesine yol açabilir. Bu yeni damarlar neovaskülarizasyona ve proliferatif DR’ye neden olmakta ve maküla ödemi, vitreus kanaması ve traksiyonel retina dekolmanı ile sonuçlanmaktadır.^1,2,3,4,5

Oksitosin (OT), hipotalamusun supraoptik ve paraventriküler çekirdeklerinde sentezlenen bir nonapeptittir. OT, etkilerini bir G proteinine bağlı OT reseptörü aracılığıyla oluşturur. Doğum sırasında uterus kasılmalarını, meme bezlerinde süt ejeksiyonu için miyoepitelyal hücre kasılmasını uyarır ve ayrıca farklı vasküler yataklarda vazokonstriktör veya vazodilatör etkileri vardır.^6,7,8 Son çalışmalarda ayrıca OT’nin anti-enflamatuvar ve anti-oksidan etkileri olduğu bildirilmiştir.^9,10 OT reseptörlerinin koni fotoreseptörlerinde ve retina pigment epitelinde bulunduğu bildirilmiştir. OT, intrasellüler Ca⁺² düzeylerini yükseltir ve etkilerini düz kas kasılması, nitrik oksit sentezi, prostaglandin üretimi, MAP-kinaz kaskadı aktivasyonu ve protein sentezini uyararak gösterir.

Daha önce yayınlanan çalışmaların sonuçları ve gözlemler ışığında bu çalışmada intravitreal ve intraperitoneal olarak uygulanan oksitosinin (OT) streptozotosin ile diyabet oluşturulmuş sıçanlarda retinopati üzerine olan etkilerini araştırmayı amaçladık.

Animals

In this study, 24 adult male and female Sprague Dawley rats weighing 200–250 g were used. Animals were fed ad libitum and housed in pairs in steel cages having a temperature-controlled environment (22±2 ^oC) with 12-hour light/dark cycles. The experimental procedures were approved by the Committee for Animal Research of Ege University. All animal studies strictly conformed to the Committee on Animal Research and Ethics guidelines. All chemicals were obtained from Sigma-Aldrich Inc. unless otherwise noted.

Deney Hayvanları

Bu çalışmada, 200-250 gr ağırlığında 24 yetişkin erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanı kullanıldı. Hayvanlar, ad libitum beslendi ve sıcaklığı kontrol edilen bir ortamda (22±2 ^oC) 12 saat aydınlık/karanlık döngüsünde çelik kafeslerde, her kafeste iki hayvan olacak şekilde bakıldı. Çalışma için Ege Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu’ndan onay alındı. Tüm hayvan çalışmalarında Hayvan Araştırmaları ve Etik Kurulu’nun belirlediği ilkelere bağlı kalındı. Aksi belirtilmedikçe tüm kimyasallar Sigma-Aldrich firmasından temin edilmiştir.

Experimental Protocol

Diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of streptozocin (STZ) (Sigma-Aldrich, Inc., Saint Louis, MO) (60 mg/kg in 0.9% NaCl, adjusted to a pH 4.0 with 0.2 M sodium citrate). Diabetes was verified after 48 h by evaluating blood glucose levels with the use of glucose oxidase reagent strips (Boehringer Mannheim, Indianapolis). Rats with blood glucose levels of 260 mg/dl (14.4 mmol/L) and higher were included in this study as diabetic rats.

The 24 rats were equally divided into 4 groups as follows: intravitreal physiological saline group, intravitreal OT group, intraperitoneal physiological saline group, and intraperitoneal OT group. The rats in the intraperitoneal groups were treated daily with either 1 mL physiological saline or 100 IU/kg OT intraperitoneally; the rats in the intravitreal groups received topical anesthesia with proparacaine hydrochloride followed by 0.01 mL physiological saline or 10 μU/μL OT in weekly intravitreal injections. Hamilton syringes fitted with 27-gauge needles were used for intraperitoneal injections while 31-gauge needles were used for intravitreal injections. After 4 weeks of treatment the rats were euthanized and blood samples were collected by cardiac puncture for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of plasma VEGF levels in the intraperitoneal treatment groups, then enucleation was performed in all groups.

Deney Protokolü

Sıçanlarda diyabet, tek doz intraperitoneal streptozosin (STZ) enjeksiyonu (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, ABD) (%0,9 NaCl’de 60 mg/kg, pH 0,2 M sodyum sitrat ile 4,0’a ayarlandı) ile oluşturuldu. Uygulamadan 48 saat sonra glukoz oksidaz reaktif şeritleri (Boehringer Mannheim, Indianapolis, ABD) kullanılarak kan glikoz düzeyleri ölçülerek diyabet tanısı doğrulandı. Kan glukoz düzeyi 260 mg/dL (14,4 mmol/L) ve daha yüksek olan sıçanlar diyabet kabul edildi ve çalışmaya dahil edildi.

Yirmi dört sıçan eşit olarak 4 gruba ayrıldı: İntravitreal serum fizyolojik grubu, intravitreal OT grubu, intraperitoneal serum fizyolojik grubu ve intraperitoneal OT grubu. İntraperitoneal gruplarda yer alan sıçanlara günlük olarak 1 mL serum fizyolojik veya 100 IU/kg OT intraperitoneal olarak verildi; intravitreal gruplardaki sıçanlara haftada bir kez proparakain hidroklorür ile topikal anestezi yapıldıktan sonra 0,01 mL serum fizyolojik veya 10 µU/OT intravitreal enjeksiyon ile verildi. Hamilton enjektörlerine yerleştirilmiş 27 G iğneler ile intraperitoneal tedaviler yapılırken 31 G iğneler ile intravitreal enjeksiyonlar yapıldı. Dört hafta tedaviden sonra sıçanlar sakrifiye edildi ve intraperitoneal tedavi gruplarında plazma VEGF seviyelerini enzim bağlı immünosorbent analizi (ELISA) için kalpten kan örnekleri alındı, sonra tüm gruplara enükleasyon yapıldı.

Immunohistochemistry

Cross-sections 2 μm in thickness were taken with a microtome (Leica MR 2145) from paraformaldehyde-fixed paraffin-embedded eye tissues, floated in a sterile bath, placed onto poly-L-Lysine-coated glass slides, and dried at room temperature. After overnight incubation at 60 °C, the slides were dewaxed in xylene for 30 min, rehydrated through a graded ethanol series (100%, 95%, 80%, and 70%, sequentially), washed in distilled H₂O and PBS for 10 min, treated with 2% trypsin containing 50 mM Tris buffer (pH 7.5) at 37 °C for 15 min, and then washed again with PBS. Sections were delineated with a Dako pen (Dako, Glostrup, Denmark), incubated in 3% H₂O₂ solution for 15 min to inhibit endogenous peroxidase activity, and washed with PBS. The slides were incubated with VEGF primary antibody at 57 °C followed by washing with PBS. Afterwards, a biotinylated secondary IgG antibody was applied and washed with PBS before incubating with the streptavidin-peroxidase conjugate (Histostain Plus, Invitrogen, Camarillo, CA, USA) for 30 min to visualize the immunostaining. The whole procedure was finished after counterstaining the sections with Mayer’s hematoxylin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). All sections were examined and photographed with an Olympus C-5050 digital camera mounted on an Olympus BX51 microscope (Olympus Corp., Tokyo, Japan).

İmmünohistokimya

Paraformaldehit ile fikse edilmiş parafine gömülü göz dokularından bir mikrotom (Leica MR 2145) ile 2 µm kalınlıkta kesitler alındı, steril bir su banyosunda yüzdürüldü ve poli-L-Lizin kaplı lamlara alınarak oda sıcaklığında kurutuldu. Bir gece boyunca 60 °C’de inkübasyondan sonra, slaytlar ksilen içinde 30 dakika boyunca parafinden arındırıldı, etanol serisinden geçirilerek hidrate edildi (sırasıyla, %100, %95, %80 ve %70), 10 dakika süre ile saf H₂0 ve PBS ile yıkandı. On beş dakika 37 °C’de 50 mM Tris tamponu (pH 7,5) içeren %2 tripsin solüsyonunda bekletildi ve daha sonra tekrar PBS ile yıkandı. Kesitlerin çevresi Dako kalemi (Dako, Glostrup, Danimarka) ile çizildi, endojen peroksidaz aktivitesini inhibe etmek için %3 H₂0₂ çözeltisi içinde 15 dakika inkübe edildi ve PBS ile yıkandı. Slaytlar, 57 °C’de VEGF primer antikoru ile inkübe edildi ve ardından PBS ile yıkandı. Daha sonra, biyotinlenmiş sekonder IgG antikor ile inkübe edildi ve immünboyanmayı görünür hale getirmek için streptavidin-peroksidaz konjugatı (Histostain Plus, Invitrogen, Camarillo, CA, ABD) ile inkübe edilmeden önce PBS ile yıkandı. İşlem, kesitlerin Mayer’in hematoksilin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, ABD) ile karşıt boyanması ile tamamlandı. Tüm kesitler Olympus BX51 mikroskobu (Olympus Corp., Tokyo, Japonya) üzerine monte edilmiş Olympus C-5050 dijital kamera ile incelendi ve fotoğraflandı.

Outer Nuclear Layer (ONL) Measurements

All sections were photographed and measured with the same Olympus C-5050 digital camera mounted on an Olympus BX51 microscope. The mean ONL thickness in the physiological saline groups was accepted as 100%.

Dış Nükleer Tabaka (ONL) Ölçümleri

Tüm kesitler Olympus BX51 mikroskobu üzerine monte edilmiş olan aynı Olympus C-5050 dijital kamera ile fotoğraflandı ve analiz edildi. Serum fizyolojik gruplarının ortalama ONL kalınlığı %100 olarak kabul edildi.

Measurement of Plasma VEGF Levels

Plasma VEGF levels were measured using a commercially available ELISA kit according to the manufacturer’s instructions (RayBiotech, Inc., GA, USA). VEGF levels were expressed in pg/mL. The detection limit was less than 2 pg/mL, and intra-assay and interassay coefficients of variation were less than 10%.

Plazma VEGF Seviyelerinin Ölçümü

Plazma VEGF seviyeleri, ticari olarak temin edilen ELISA kiti (RayBiotech, Inc., GA, ABD) kullanılarak üreticinin talimatlarına uygun şekilde ölçüldü. VEGF seviyeleri pg/mL olarak ifade edildi. Testin algılama sınırı 2 pg/mL’nin altındaydı ve analiz içi ve analizler arası değişim katsayıları %10’dan düşüktü.

Statistical Analysis

Data analyses were performed using SPSS version 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). The groups of parametric variables were compared using Student’s t-test. The groups of non-parametric variables were compared with the Mann-Whitney U test. The results were reported as mean ± standard error of mean. A value of p<0.05 was accepted as statistically significant.

İstatiksel Analiz

İstatiksel analizler Windows için SPSS (SPSS Inc., Şikago, IL, ABD) sürüm 15,0 kullanılarak gerçekleştirildi. Parametrik değişken grupları, Student t-testi kullanılarak karşılaştırıldı. Parametrik olmayan değişken grupları Mann-Whitney U testi ile karşılaştırıldı. Sonuçlar ortalama ± standart hatası olarak bildirildi. İstatistiksel açıdan p değerinin 0,05’ten küçük olması anlamlı kabul edildi.

VEGF protein ekspresyonu immünohistokimya ile incelendi ve ONL kalınlığı ölçüldü. Ekspresyon aşağıdaki gibi skorlandı: 0, hiçbir ekspresyon olmadığını; 1, 2 ve 3 sırasıyla %0-24, %25-49, %50-74 ve %75’den fazla ekspresyon olduğunu göstermektedir. ONL ölçümleri ve boyama yoğunluklarının karşılaştırılması, 10 farklı kesitin X40 büyütme değerlendirilmesi ile gerçekleştirildi.

ONL Measurements

Figure 1 represents the alterations in retinal ONL thickness in the study groups. Results from the comparison of ONL thickness between groups is shown in Table 1. Morphometric analysis of the rat retinal cross-sections showed that intravitreal and intraperitoneal OT significantly increased ONL thickness compared to physiological saline-treated groups (23% and 25%, respectively, p<0.001).

ONL Ölçümleri

Şekil 1, çalışma gruplarında retina ONL kalınlığındaki değişiklikleri göstermektedir. Gruplar arasında ONL kalınlığının karşılaştırılmasından elde edilen sonuçlar Tablo 1’de gösterilmiştir. Sıçan retina kesitlerinin morfometrik analizi, intravitreal ve intraperitoneal OT tedavisinin serum fizyolojik ile tedavi edilen gruplara kıyasla ONL kalınlığını anlamlı şekilde arttırdığını göstermiştir (sırasıyla %23 ve %25, p<0,001).

VEGF Protein Expression

Figure 2 demonstrates VEGF protein expression in the rat retina after cessation of treatment. The mean score for VEGF expression in the intraperitoneal physiological saline group was 1.6±0.2, which decreased significantly to 0.3±0.2 in the intraperitoneal OT group. In the intravitreal treatment groups, the VEGF expression score was 1.3±0.3 in the physiological saline group, which decreased significantly to 0.3±0.2 in the OT group.

VEGF Protein Ekspresyonu

Şekil 2, tedavi kesildikten sonra sıçan retinasındaki VEGF protein ekspresyonunu göstermektedir. İntraperitoneal serum fizyolojik grubunda VEGF ekspresyonu skoru 1,6±0,2 idi ve intraperitoneal OT grubunda ekspresyon anlamlı şekilde 0,3±0,2’ye düştü. İntravitreal tedavi gruplarında VEGF ekspresyon skoru serum fizyolojik grubunda 1,3±0,3 idi, OT grubunda ise 0,3±0,2’ye düştü.

Plasma VEGF Levels

Plasma VEGF level was 161.29±47.36 pg/mL (range: 115.75-225.25) in the intraperitoneal saline group and 76.74±14.15 pg/mL (range: 25.50-142.75) in the intraperitoneal OT group. There was a statistically significant difference between the groups.

Plazma VEGF Seviyeleri

Plazma VEGF düzeyi intraperitoneal serum fizyolojik grubunda 161,29±47,36 pg/mL (aralık: 115,75-225,25 pg/mL) ve intraperitoneal OT grubunda 76,74±14,15 pg/mL (aralık: 25,50-142,75 pg/mL) olarak ölçüldü. Gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı fark vardı.

Bildiğimiz kadarıyla, çalışmamız OT’nin diyabetik sıçanlarda retina üzerine etkilerinin araştırıldığı ilk çalışmadır. Sonuçlarımız, OT’nin diyabetik sıçanlarda VEGF protein ekspresyonu ve plazma VEGF seviyelerini azaltarak ve dış nükleer tabakanın incelmesini önleyerek, retinayı koruyucu etkilere sahip olduğunu gösterdi.

DR’nin patogenezi daha iyi anlaşıldıkça, yeni tedavi seçeneklerinin ortaya çıkması olasıdır. DR patogenezinde etkili olduğu öngörülen mekanizmalar hiperglisemi, ileri glikasyon son ürünlerinin (AGE) akümülasyonu, protein kinaz C aktivasyonu, oksidatif stres ve enflamasyondur. Kronik hiperglisemi, reaktif oksijen türlerinin yapımına ve düşük dereceli enflamasyona neden olur. Bu, retinal pigment epitelinde apoptozu indükler ve DR’nin progresyonuna neden olur. Hiperglisemi ayrıca endotel tabakasının altında AGE akümülasyonuna neden olur ve vasküler yapıyı değiştirir, damar sertliğini artırır ve oksidatif stres ve enflamasyona yol açan hücre içi sinyal yolaklarını başlatır. Oksidatif stres, DR etiyolojisinde en yaygın mekanizma olarak kabul edilir. Oksidatif strese bağlı hasar veya disfonksiyon kan şekeri kontrol altına alındıktan sonra bile devam edebilir. Enflamasyon aynı zamanda DR progresyonu ve komplikasyonların ortaya çıkmasında önemli rol oynar. Bu nedenle, oksidatif stres ve enflamasyonu hedef alan yeni tedavi stratejileri geliştirilmelidir.^{1,13,14,15,16,17,18,19,20}

OT bir nonapeptittir ve reseptörlerinin, böbrek, kalp, pankreas, adipositler ve timus dahil olmak üzere farklı dokularda bulunduğu gösterilmiştir. OT’nin immün ve enflamatuvar modülasyondaki rolü iyi tanımlanmış ve bunu reseptörlerinin aktivasyonuna bağlı olduğu bildirilmiştir.^6,7,8,21 Bu çalışmalara dayanarak, OT’nin bir antioksidan ve anti-enflamatuvar etki gösterebileceğini ve bu nedenle DR’de bir terapötik madde olarak kullanılabileceğini düşünüyoruz. Koni fotoreseptörleri ve retina pigment epitelinde OT reseptörleri bulunmaktadır. Bu reseptörlerin aktivasyonu, hücre içi Ca⁺² düzeylerini arttırır ve sonraki basamaklarda fosfolipaz C ve fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın aktivasyonuna neden olur.^13,14

Diyabetik hastalarda, sürekli hiperglisemi retina kan akımında düzensizliğe, perisitlerin kaybına, bazal membranın kalınlaşmasına, mikroanevrizmalara, kapiller oklüzyona ve iskemiye neden olabilir. İskemi, sonuç olarak tirozin kinaz reseptörleri, VEGFR-1 ve VEGFR-2’yi aktive eden VEGF’nin yapımına yol açar.²² VEGF, anjiyojenez ve kan-retina bariyerinin yıkımını destekleyen bir büyüme faktörü ve güçlü bir vazoaktif sitokindir ve endotelyal hücre büyümesi ve neovaskülarizasyonu indükler.^23,24 Matsuoka ve ark.²⁵, diyabetik retinalarda VEGF ekspresyonunun anlamlı derecede arttığını bildirirken, Funatsu ve ark.²⁶, sağlıklı bireyler ve retinopatisi olmayan diyabetik hastalara kıyasla retinopatili diyabetik hastalarda vitreus ve plazmada VEGF seviyelerinin yükseldiğini bildirmiştir. Bu görüşle uyumlu olarak, Aiello ve ark.²⁷, retina iskemisi olan hastalarının oküler sıvılarında VEGF konsantrasyonunun arttığını bulmuştur. Çalışmamızda retinada VEGF ekspresyonu ve plazma VEGF düzeylerinin arttığı bulundu ve OT tedavisi ile ekspresyon ve plazma seviyelerinde anlamlı azalma meydana geldi.

Diyabetik sıçanlarda dış nükleer tabakanın inceldiği bildirilmiştir. Bazı çalışmalarda bu incelemenin apoptoz nedeniyle ortaya çıktığı ileri sürülmüştür.^28,29,30 Çalışmamızda, daha önce yapılan çalışmalar ile uyumlu şekilde, OT tedavisinin, STZ ile indüklenen diyabetik sıçanlarda serum fizyolojik grubuyla karşılaştırıldığında ONL incelmesini engellediği bulunmuştur.

Sonuç olarak, STZ ile indüklenen diyabetik sıçanların OT tedavisi retina dejenerasyonunu azaltmada etkili olmuştur. VEGF ekspresyonu ve plazma VEGF düzeylerinde belirgin azalma ve retina incelmesine karşı koruyucu etki, OT’nin diyabetik retinopatide alternatif bir tedavi olabileceğini düşündürmektedir. OT’nin diyabetik retina dejenerasyonundaki yararlı etkileri, antioksidan ve anti-enflamatuvar etkileri aracılığı ile ortaya çıkıyor olabilir. Bildiğimiz kadarıyla, çalışmamız OT’nin diyabetik sıçanlarda retina üzerine etkilerinin araştırıldığı ilk çalışmadır ve bu konuda daha ileri çalışmaların yapılmasına gereksinim vardır.